Несмотря на?значительные успехи, достигнутые в?борьбе с?инфекционным процессом, ассоциированным с?оказанием медицинской помощи, уровень заболеваемости и?развития осложнений данной патологии остается высоким. Кроме того, имеются серьезные проблемы в?диагностике и?лечении этих инфекций, что является основой формирования хронических недугов и?развития рецидивов.
Последние 20 лет ознаменовались появлением новых представлений об?организации жизни бактерий, особенностях их существования в?организме человека. Основные открытия в?этой области связаны с?изучением биопленок. Свыше 20 тыс. публикаций посвящено?исследованию инфекций, протекающих с?формированием биопленки?[1]. Накопленные данные свидетельствуют о?свойствах бактерий в?составе сообществ, наиболее актуальным из?которых для практической медицины следует считать повышенную выживаемость микроорганизмов в?биопленках. Поэтому именно последние считаются главным фактором, способствующим возрастанию числа воспалений инфекционной этиологии при нахождении пациента в?стацио­наре?[2]. По?сведениям?[3, 4], до?80% инфекционной патологии человека связано с?образованием биопленок. Также отмечена роль микробных конгломератов в?возникновении и?развитии более чем 65% инфекций после получения медицинской помощи.
Обнаружение бактерии – продуцента биопленки свидетельствует о наличии в организме хронической инфекции. В?современной зарубежной литературе есть термин «инфекция, ассоциированная с?биопленкой»: «biofilm-associated infections» и?«biofilm-related infection». Такие инфекции делятся на?две группы?[2]:
связанные с?медицинскими устройствами: обусловлены формированием биопленок на?поверхностях контактных линз, искусственных клапанов сердца, эндотрахеальных трубок, периферических и?центральных внутрисосудистых катетеров, мочевых катетеров, ортопедических имплантов и?искусственных суставов (появляются новые нозологические формы, например катетер-ассоциированные инфекции);
инфекции тканей: хронические отиты, синуситы, тонзиллиты, ларингиты; эндокардиты, инфекции легких, муковисцидоз, мочекаменная болезнь, воспаления мочевыводящих и?желчевыводящих путей, остеомиелит и?хронические раны.
По данным?[3], инфекциями, ассоциированными с?биопленкой, болеют 17 млн человек, затраты на?лечение составляют 94 биллиона долл.
В настоящее время доказано, что биопленку способны образовывать более 90% изученных видов бактерий. Она может состоять из?одного их вида, а?также бывает полимикробной. Ее биомасса внедрена в?толстый слизистый слой из?полисахаридов, липополисахаридов и?гликопротеинов?[5]. Этот экзополисахаридный матрикс (ЭПМ, или внеклеточное полимерное вещество) синтезируется самими бактериями биопленки после их адгезии к?поверхности и?защищает микроорганизмы от?внешних воздействий. Внеклеточный матрикс составляет 80–90% массы биопленки, а?бактерии – 10–20%?[6–8]. ЭПМ обеспечивает прочное прикрепление биопленки к?различным поверхностям и?является основным маркером ее зрелости и?выраженности?[5].
Для инфекций с?ключевым значением биопленки в?патогенезе характерна резистентность к?антибактериальной терапии, что обусловлено защитной ролью внеклеточного полимерного вещества, а?также низкой метаболической активностью бактерий в?биопленке. Матрикс служит барьером для действия компонентов иммунной системы макроорганизма, что создает предпосылки для формирования неэффективного иммунного ответа. Бактериальная биопленка способна глубоко проникать в?ткани, индуцируя хроническое воспаление, а?это приводит к?прогрессирующему или осложненному течению заболевания. При этом бактерии, включенные в?матрикс, могут отрываться от?конгломерата, циркулировать в?жидкостях тела с?образованием новых очагов.
Актуальность биопленки в?патогенезе инфекционного процесса обосновывает необходимость использования лабораторных методов ее определения. Несмотря на?более чем 20-летнюю историю изучения биопленок, пока не?разработано неинвазивных и?доступных для широкого применения способов их анализа?[1, 5]. Косвенными признаками биопленки считаются резистентность к?антимикробным препаратам и?расхождение результата посева с?клиническим состоянием?[2]. Классическое бактериологическое исследование средствами лабораторной микробиологии оптимизировано для выращивания планктонных бактерий и?не?предназначено для оценки формирования биопленки?[1, 6]. С?целью максимально эффективного воздействия на?инфекционный процесс стандартная микробиологическая диагностика в?клинической практике должна быть дополнена доступными, быстрыми и?информативными методами анализа бактериальной биопленки. При этом бак­посев может быть использован для выделения культуры бактерий, входящих в?ее состав?[2].
В ходе разработки нами лабораторного метода количественной оценки способности бактерий создавать биопленку в?качестве объекта для изучения при различных клинических ситуациях определены микроорганизмы, выделенные из?хронических ран (ХР). Считают, что ХР является типичной патологией, ассоциированной с?биопленкой?[8–12]. Достаточное количество публикаций подтверждает трансформацию бактерий из?планктонной формы в?биопленку и?ее первостепенную патогенетическую роль в?задержке раневого заживления. Применение высокотехнологичных и?высокоинформативных методов визуализации (сканирующая электронная, конфокальная лазерная, атомно-силовая и?электронная микроскопии, иммуногистохимическое исследование) и?молекулярно-генетических технологий (ПЦР, гибридизация in situ FISH) доказало колонизацию ХР биопленкой?[13–16].
Объектом изучения стали штаммы S. аureus, выделенные из?хронических ран пациентов, находившихся на?лечении в?ожоговом отделении Гомельской городской клинической больницы №1. Материалом для исследования послужило раневое отделяемое, собранное стерильными тупферами по?стандартной технологии?[5] и?помещенное в?транспортную среду Amies. В?течение 2 ч материал доставляли в?лабораторию клеточных технологий РНПЦ радиационной медицины и?экологии человека, где осуществляли все нижеприведенные испытания.
Выделение бактерий выполняли путем секторального посева раневого отделяемого на?плотные питательные среды. Идентификацию выделенных штаммов проводили на?автоматическом микробиологическом анализаторе VITEK 2 Compact (BioMerieux, Франция), а?способность образования бактериальной биопленки штаммами S. aureus оценивали по?собственной методике (патент Республики Беларусь №20326). Для анализа использовали суточную культуру бактерий в?планктонной фазе, суспензированную в?5 мл жидкого триптиказо-соевого бульона, содержащего 0,25% глюкозы (1,5?108 КОЕ/мл или 0,5 по?McFarland). Полученную суспензию бактерий разделяли на?две одинаковые части. Первую инокулировали в?лунку стерильного плоскодонного пластикового иммунологического планшета в?количестве по?100 мкл. Во?вторую часть суспензии добавляли 50 мкл 0,1% водного раствора Congo red и?инокулировали во?вторую лунку этого?же планшета в?количестве 100 мкл. Оценку формирования биопленки проводили в?динамике: результаты снимали через 2, 4, 6, 18, 24, 48 ч инкубации в?оптимальных для роста бактерий температурных условиях. По?окончании каждого срока инкубации планктонные клетки из?обеих лунок удаляли пипетированием, планшет трехкратно промывали 10 мМ фосфатным буферным раствором (рН 7,2). В?первую лунку для детекции накопления биомассы биопленки добавляли 50 мкл 0,1% раствора генцианвиолета и?оставляли при комнатной температуре на?10 минут для окраски. Несвязавшийся краситель удаляли путем однократной отмывки 10 мМ фосфатным буфером. Затем в?лунку добавляли 200 мкл 95% этанола для экстракции связавшегося с?биомассой красителя. Во?вторую лунку также вносили 200 мкл 95% этанола для экстракции связавшегося с?ЭПМ красителя Congo red в?процессе инкубации. 125 мкл раствора генцианвиолет/этанол из?первой лунки и?125 мкл раствора Congo red / этанол из?второй переносили в?оптически чистые лунки. Количественную оценку полученных спиртовых экстрактов осуществляли на?микропланшетном спектрофотометре (иммуно­ферментный ридер Sirio, Seac Radium Group, Италия). Оптическую плотность элюатов генцианвиолет/этанол и?Congo red / этанол определяли при длине волны 540 и?490 нм соответственно. Контролем служили лунки, в?которые добавляли только жидкую питательную среду без бактерий. Все действия для контрольных лунок были аналогичными таковым для опытных образцов.
Для сравнения полученных данных и?определения значений, характеризующих различную степень способности формировать основное вещество биопленки, использовали метод?[17]. Для этого анализируемые штаммы S. aureus выращивали на?поверхности плотной питательной среды, содержащей сердечно-мозговой бульон (37 г/л), сахарозу (50 г/л), агар (10 г/л) и?Congo red (0,8 г/л). Образование биопленки бактериями оценивалось по?окраске выросших колоний. Отсутствие активности регистрировалось по?розовому цвету колоний, а?наличие более темной, красной окраски центра колоний свидетельствовало о?слабой вероятности создания биопленки; умеренная способность соответствовала красно-коричневому, а?выраженная – черному цвету колоний.
Учитывая условия культивирования бактерий в?лунках планшетов и?время, необходимое на?формирование биопленки in vitro, сравнение результатов двух методов производили через 24 ч после инкубации. Сопоставляли показатели оптической плотности элюатов Congo red / этанол и?цвета выросших колоний на?поверхности Congo red агара.
Для подтверждения информативности предложенного нами метода применяли визуализацию полученной биопленки с?помощью атомно-силового микроскопа NT 206 (ОДО «Микротестмашины»), находящегося на?базе научно-исследовательской лаборатории Гомельского государственного медицинского университета. Полученные изображения обрабатывали в?программе SurfaceXplorer. Подготовленную суспензию бактерий высевали газонным способом на?поверхность плотной питательной среды Мюллер–Хинтона. Поверх засеянной суспензии помещали предметные стекла размером 1?1 см.?Чашки Петри инкубировали в?термостате при 37 ?С в?течение 24 ч. Затем предметные стекла осторожно извлекали, высушивали при комнатной температуре и?исследовали в?атомно-силовом микроскопе. Поверхность сформированной биопленки сканировали в?режиме постоянного контакта, используя коммерческие кантилеверы из?нитрида кремния с?жесткостью около 0,1 N/m (Micromash, США). Статистический анализ полученных результатов проводился непараметрическими методами – W-критерия Вилкоксона, U-критерия Манна–Уитни, а?частотный – в?таблицах сопряженности 2?2 при помощи критерия ?2 с?поправкой Йетса. Различия считали значимыми при р<0,05.
Как известно, основные объекты для изучения биопленки – способность бактерий к?адгезии и?накоплению биомассы, а?также образование основного вещества (ЭПМ). Наиболее широко применяется в?практике лабораторной микробиологии количественный метод оценки адгезивной активности и?определения биомассы биопленки, разработанный Г.?Кристенсеном в?1985?г.?[18]. Для установления формирования основного вещества распространен качественный метод, описанный в?[17].
В нашей работе использован количественный метод Г.?Кристенсена, однако с?некоторыми модификациями. Так, вместо рекомендованной оценки результатов через 18 ч инкубации мы дополнительно проверяли накопление биомассы и?адгезивную активность микроорганизмов спустя 2, 4, 6, 24 и?48 ч. Через аналогичные временные интервалы проводили анализ способности бактерий к?образованию основного вещества биопленки. При этом применяемый для окраски экзополисахаридного матрикса краситель Congo red добавляли в?инкубируемую в?лунках планшета бактериальную суспензию, а?не?в?плотную питательную среду, как было предложено в?[17]. Разработанный нами метод позволяет одновременно количественно просчитать как образование биомассы биопленки, так и?накопление основного вещества.
Для оптимального выражения контрольного значения и?установления исходного уровня, превышение которого можно интерпретировать как наличие способности формировать биопленку, взяли следующую формулу?[18]: ODк = ХсрODконтроля + 3?SDконтроля, где ХсрODконтроля – среднее арифметическое значение оптической плотности, измеренной для контрольных лунок, SDконтроля – среднеквадратичное (стандартное) отклонение контрольных значений. Использование трех стандартных отклонений позволяет охватить 99,7% всех вариантов и?максимально точно оценить дисперсию данных.
Средний показатель OD, зафиксированный нами для контрольных лунок, составил 0,05 ед., величина стандартного отклонения была равна 0,023 ед. Рассчитанное по?формуле значение ОDк – 0,120 ед. – послужило в?дальнейшем исходной точкой при оценке результатов для опытных лунок, содержащих бактерии. Показатели ниже 0,120 ед. свидетельствовали об?отсутствии способности микроорганизмов формировать биопленку. Для определения количественных параметров, характеризующих низкую, умеренную и?выраженную вероятность накопления ЭПМ, полученные значения оптической плотности элюатов Congo red / этанол, измеренные после 24-часовой инкубации бактерий в?лунках планшетов, сравнивали с?итогами анализа этих?же бактерий методом?[17]. На?рисунке представлен внешний вид планшета, содержащего спиртовые экстракты Congo red и?генцианвиолета, после постановки исследования способности S. aureus формировать биопленку по?разработанной нами методике.
При сравнении двух методов выявлено соответствие полученных результатов, определяющих отсутствие способности бактерий накапливать основное вещество биопленки. Так, при значениях оптической плотности раствора Congo red / этанол ?0,120 ед. (то есть ниже или равно ODк) анализируемые микроорганизмы имели розовый цвет колоний при культивировании на?поверхности Congo red агара. Низкий уровень образования внеклеточного матрикса, распознаваемый по?розовому цвету колоний с?более темной окраской их центра, соответствовал диапазону OD от?0,120 до?0,240 ед. Красно-коричневый или бордовый цвет давали бактерии, имеющие умеренную способность формировать основное вещество. Согласно результатам предложенного нами метода, значения оптической плотности экстракта Congo red / этанол для этих микроорганизмов варьировали от?0,240 до?0,480 ед. (то есть от?2?ODк до?4?ODк). Бактерии, для которых OD спиртового экстракта Congo red превышала 0,480 ед. (то есть более 4?ODк), характеризовались высоким накоплением ЭПМ и?на?поверхности Congo red агара имели практически черный цвет колоний (таблица).
Метод?[17], в?котором продукция основного вещества оценивается по?цвету колоний, выращенных на?поверхности Congo red агара, – распространенный качественный способ анализа формирования биопленки. Он высокоинформативен (чувствительность до?90%, специфичность до?100%), что подтверждено в?сравнительном исследовании на?базе молекулярно-генетических технологий (выявление посредством ПЦР генов, отвечающих за?различные процессы в?появлении микробных биопленок)?[19]. Значительные показатели диагностической ценности, использование для детекции красителя Congo red, являющегося специфичным для ЭПМ, послужили нам основанием для выбора данного метода в?качестве сравнительного. При его помощи мы выделили количественные характеристики выраженности формирования матрикса биопленки.
Установленные интервалы значений оптической плотности (таблица) применяли и?для такого признака биопленки, как образование биомассы. При этом измерения проводились для экстрактов генцианвиолет/этанол. Как известно, генцианвиолет окрашивает микробную клетку, поэтому замер OD этанольного экстракта, содержащего связавшийся с?бактерией краситель, будет определять различную степень адгезии и?накопления биомассы и?отражать пролиферацию микробных клеток. Оценка микробной биомассы через 18 ч инкубации в?лунках иммунологических планшетов с?использованием генцианвиолета – известная методика, предложенная ранее Г.?Кристенсеном?[18]. Ее диагностическая информативность высока, показатели специфичности и?чувствительности составляют 94 и?98% соответственно, что так?же, как и?в?методе?[17], было подтверждено ПЦР?[19].
Мы рекомендуем производить измерения оптической плотности спиртовых экстрактов генцианвиолета через 2, 4, 6, 18, 24 и?48 ч инкубации бактерий в?лунках планшета. Это является основной нашей модификацией метода Г.?Кристенсена и?позволяет описать образование биомассы биопленки во?времени, а?не?по факту. Синхронно в?других лунках планшета производится анализ способности бактерий синтезировать ЭПМ. При этом используется определение OD раствора красителя Congo red, который в?процессе инкубации бактерий в?течение 2, 4, 6, 18, 24 и?48 ч связался с?экзополисахаридным матриксом и?окрасил его.
Таким образом, предложенная нами методика позволяет одновременно провести количественную оценку адгезивной способности, накопления биомассы и?основного вещества биопленки. Анализ биопленки рекомендуем производить в?динамике, что позволяет охарактеризовать наиболее важные временные параметры ее формирования.

Окончание в?следующем номере.
Статья поступила в?редакцию 03.02.2016?г.

Summary
It is presented the new laboratory method of detection of bacterial biofilm formation in the article. This method includes the quantitative measurement of biofilm biomass accumulation and biofilm slime production. The formation of the biofilm is modeled in sterile 96-well polysterene microtiter plates. Congo red and crystal violet stains are used to visualise both the matrix and bacteria cells concomitant with simultaneous cultivation of the bacteria. The extraction of the stain connected to the biofilm is achieved with 95% ethanol. The optical density of each sample at a wavelength of 540 nm (for crystal violet/ethanol solution) and 490 nm (for Congo red/ethanol solution) is measured with a microplate reader. All the examined strains of bacteria are divided into the following categories: no biofilm producers, weak, moderate, or strong biofilm producers accordingly the digital data of the optical density measured for stained with crystal violet and Congo red bacterial films. The described method will be useful in medical practice for the diagnostics of the biofilm-related infection: healthcare-associated infection, device-related infections, chronic tissue infections and for the optimization of the infection treatment protocols.

Литература
1. Wolcott R.?The role of biofilms: are we hitting the right target? Current concepts in wound Healing: Update 2011 / R.?Wolcott, S.?Down // Plastic and reconstructive surgery. 2011. №1S, vol. 127. P. 28S 37S.
2. Lebeaux D.?From in vitro to in vivo models of bacterial biofilm-related infections / D.?Lebeaux?[et al.] // Pathogens. 2013, №2. P. 288–356.
3. U.?S.?Department of Health and Human Services. Immunology of biofilms. 2007 // http://grants.nih.gov/grants/guide/pa-files/PA 07–288.html.
4. NIH RESEARCH ON MICROBIAL BIOFILMS // http://grants.nih.gov/grants/ guide/pa-files/PA 03–047.html.
5. Percival?S.?L.?Biofilms and wounds: an overview of the evidence / S.?L.?Percival, S.?M.?McCarty, Lipsky B. // Advances in Wound Care. 2015, №7. Vol. 4. P. 373–381.
6. Why chronic wounds will not heal: a novel hypothesis / Bjarnsholt T., Kirketerp-M?ller K., Jensen?P. et al. // Wound Repair Regen. 2008, №1. Vol. 16. P. 2–10.
7. Структурно-функциональная характеристика бактериальных биопленок / Т.?А.?Смирнова?[и др.] // Микробиология. 2010, №4. Т. 79. С. 435–446.
8. Zhao G.?Bio?lms and In?ammation in Chronic Wounds / G.?Zhao?[et al.] // Advances in wound care. 2013, №7. Vol. 2. Р. 389–399.
9. Young L.?Identifying infection in chronic wounds // Wound Practice and Research. 2012, №20. Vol. 20. P. 38–44.
10. Biofilms: a diagnostic challenge in persistent infections / S.?Mengi?[et al.] // International Journal of Research in Medical and Health Sciences. 2013, №3. Vol. 2. Р. 1–9.
11. Martin?J.?M.?Molecular microbiology: new dimensions for cutaneous biology and wound healing / J.?M.?Martin, J.?M.?Zenilman, G.?S.?Lazarus // J Invest Dermatol. 2010. Vol. 130. P. 38.
12. Grice?E.?A.?Interaction of the microbiome with the innate immune response in chronic wounds / E.?A.?Grice, J.?A.?Segre // Adv Exp Med Biol. 2012. Vol. 946. P. 55.
13. Pseudomonas aeruginosa bio?lm aggravates skin in?ammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model / H.?Trшstrup // Wound Repair Regen. 2013. Vol. 21. P. 292.
14. Distribution, organization, and ecology of bacteria in chronic wounds / K.?Kirketerp-M?ller // J Clin Microbiol. 2008, №8. Vol. 46. P. 2717–2722.
15. Why chronic wounds will not heal: a novel hypothesis / Bjarnsholt T.?[et al.] // Wound Repair and Regeneration. 2008. Vol. 16. P. 2–10.
16. Understanding the host in?ammatory response to wound infection: an in vivo study of Klebsiella pneumoniae in a rabbit ear wound model / Seth AK.?[et al.] // Wound Repair Regen. 2012. Vol. 20. P. 214.
17. Freeman?D.?J.?New method for detecting slime production by coagulase negative staphylococci / D.?J.?Freeman, F.?R.?Falkiner, C.?T.?Keane // J.?Clin. Pathol. 1989. Vol. 42. P. 872–874.
18. Adherence of coagulase-negative staphylococci to plastic tissue culture plates: a quantitative model for the adherence of Staphylococci to medical devices / G.?D.?Christensen?[et al.] // Journal of clinical microbiology. 1985, №6. Vol. 22. Р. 996–1006.
19. Oliveira A.?Comparison of methods for the detection of biofilm production in coagulase-negative staphylococci // BMC Research Notes. 2010, №3. Vol. 260. P. 1–8.
20. Ярец?Ю.?И.?Динамика микробного состава хронической раны с учетом особенностей предоперационной подготовки / Ю.?И.?Ярец, Н.?И.?Шевченко, Л.?Н.?Рубанов // Проблемы здоровья и экологии. 2012, №2. Т. 32. С. 108–114.